11 Апреля 2023
Автор: Андрей Алексеевич Авраменко — м.н.с. лаборатории биоинформатики НИИ антимикробной химиотерапии (Смоленск).
***
«Агар Мюллера-Хинтон» — это твёрдая питательная среда, предназначенная для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом, а также для первичного выделения нейссерий. Среда была разработана в 1941 году американскими микробиологами Джоном Мюллером (John Howard Mueller; 1891-1954) и Джейн Хинтон (Jane Hinton; 1919-2003).
Джон Мюллер родился в захолустном городке на Северо-Востоке США в семье унитарианского священника. Пропуская мимо ушей проповеди отца о том, что мир вокруг нас непознаваем и создан по воле Всевышнего, маленький Джонни с детства проводил простейшие химические опыты у себя на заднем дворе и изучал всевозможных бабочек, жучков и прочую живность. Он очень рано пришёл к выводу о том, что окружающий мир был полон загадок, однако при этом подчинялся строгим законам, изучению которых Джонни и собирался посвятить всю свою дальнейшую жизнь. Он получил блестящее биологическое образование и в 1914 году впервые после макромира заинтересовался микромиром: в то время бактериология в США переживала эпоху своего расцвета, поэтому внимание лучших юных умов было направлено на эту область медицины. В 1916 году Джон Мюллер защитил докторскую диссертацию и устроился на должность ассистента патологоанатома в университетской клинике в Нью-Йорке, но уже через год гражданский долг призвал его отправиться в составе Американского экспедиционного корпуса на поля сражений Первой мировой войны. Мюллер прибыл во Францию в звании рядового медицинской службы, однако его знания и талант сразу же нашли себе применение, когда сотни американских солдат начали заболевать «окопной лихорадкой». Исследуя патогенез этого заболевания, он смог доказать его трансмиссивную природу (т.е. передачу вшами), за что командование повысило его до лейтенанта и сделало начальником полевой лаборатории.
Вернувшись на родину героем, Джон Мюллер вплотную занялся исследованием культуральных свойств патогенных бактерий. В 1922 году при разработке питательной среды для гемолитического стрептококка, он открыл новую аминокислоту, содержащуюся в гидролизате казеина — «метионин». За это достижение Мюллер был удостоен звания доцента в Гарвардской медицинской школе, что, как ни странно, затормозило его научную карьеру. Всё дело было в том, что в 1925 году британец Уильям Ги (William Ewart Gye; 1889-1952) опубликовал в журнале Lancet свою революционную «двухфакторную» теорию вирусного онкогенеза, которая опиралась на более ранние исследования саркомы у домашней птицы Фрэнсиса Рауса. Гарвардское начальство, поддавшись новомодным веяниям в науке и пытаясь успеть запрыгнуть в набиравший обороты «онкологический экспресс», приказало Мюллеру срочно оставить его бесперспективную работу по метаболизму бактерий и максимально сконцентрироваться на новой проблеме. Уже спустя год после работы над теорией Уильяма Ги Джон Мюллер пришёл к заключению, что эксперимент, описанный британцем в статье, невоспроизводим, а приведённые им выводы сомнительны. На протяжении последующих лет Мюллер упрямо и методично пытался доказать всем, что т.н. «двухфакторная» теория Ги несостоятельна, однако начальство не верило ему. В 1927-ом руководство Гарвардской медицинской школы, предложив Уильяму Ги огромной гонорар, переманило его в своё онкологическое подразделение в Бостоне, где тот должен был продолжать работу над своей «теорией». Лабораторию, в которой проводил опыты британец, возглавлял Мюллер — это была настоящая дуэль двух непримиримых учёных мужей. Непрестанно критикуя друг друга по любому поводу, они, тем не менее, нашли в себе достаточно сил и терпения, чтобы провести совместную серию экспериментов и опубликовать в 1929 году статью, где каждый из них привёл в заключении свои выводы. Мюллер считал, что Ги неверно интерпретировал результаты экспериментов, и был в этом абсолютно прав, но для всех это стало очевидным лишь спустя ещё один год. После краха своей теории Уильям Ги отправился обратно в Европу, а Мюллер получил карт-бланш от руководства Гарварда на проведение собственных исследований.
С досадой вспоминая о потраченных в пустую пяти годах своей жизни, Джон Мюллер с жадностью и азартом принялся за новую работу, выбрав объектом своих опытов бациллу дифтерии. За несколько лет он смог определить, какие аминокислоты необходимы для роста дифтерийной палочки, и сделал важное наблюдение, что разные штаммы одной и той же бактерии сильно различались по потребностям в аминокислотах. Экспериментируя с различными веществами, он показал, что никотиновая кислота, пантотеновая и пимелиновая (в следовых количествах) являются важными факторами роста для всех протестированных им штаммов дифтерийной палочки. Секрет его успеха, во многом, был связан с тем, что для количественного измерения бактериального роста он использовал биохимический метод Кьельдаля, основанный на определении общего азота в клетках — метод был трудоёмким и утомительным, зато достаточно точным. Работа Мюллера с возбудителем дифтерии имела впоследствии важное практическое значение для здравоохранения, т.к. помогла оптимизировать производство дифтерийного анатоксина.
В 1939 году в лабораторию к Мюллеру пришла молодая чернокожая девушка — Джейн Хинтон — однако рассказ о ней стоит начать с биографии её отца: Уильяма Августа Хинтона (William Augustus Hinton; 1883-1959). Уильям Хинтон родился на юге Америки в семье бывших рабов, освобождённых после Гражданской войны. Преодолевая нищету и расовые предрассудки, благодаря лишь своему врождённому таланту и титаническому труду он смог накопить достаточно денег, чтобы поступить в Гарвардскую медицинскую школу. Закончив её с отличием в 1912 году, Уильям хотел продолжить обучение, чтобы стать полноценным врачом, однако все клиники Бостона отказали ему в интернатуре из-за цвета кожи. Тогда он решил избрать для себя более незаметную стезю бактериолога: руководство университетской больницы «любезно» предложило ему неоплачиваемую должность лаборанта. Набравшись опыта и увлёкшись проблемой сифилиса, Хинтон занялся собственными исследованиями, которые привели его к созданию широко известного в США диагностического теста, основанного на явлении флокуляции. «Серологический тест Хинтона на сифилис» получил высокую оценку Службы общественного здравоохранения за свою скорость, простоту использования и отсутствие ложноположительных результатов. Разработка этого теста принесла ему несколько руководящих должностей в лабораториях штата, а также возможность вести курс по бактериологии и иммунологии в Гарварде. В 1921 году Уильям Хинтон стал первым чернокожим членом Американского общества по микробиологии (ASM), однако ни разу в жизни не участвовал в его заседаниях, т.к. боялся, что, когда все узнают о цвете его кожи, то исключат. Впоследствии, продолжая заниматься исследовательской и образовательной деятельностью, Хинтон стал всемирно признанным экспертом по диагностике и лечению сифилиса, автором книг и учебников, лауреатом нескольких премий, а также был удостоен звания профессора — то к чему он стремился с первого дня, после того как пересёк порог Гарвардской медицинской школы.
В 1909 году Уильям Хинтон женился на скромной школьной учительнице, которая родила ему двух дочерей: Энн и Джейн. Младшая дочь всегда была смелой и уверенной в себе девушкой. Она отучилась в частном женском колледже в Бостоне, где увлекалась биологией, посещала музыкальные классы, пела в хоре, а также была старостой курса и главой студенческого общества. Она, как и отец, мечтала стать учёным-бактериологом, однако вскоре после окончания колледжа Джейн Хинтон пришлось столкнуться не только с расовой дискриминацией, но и с гендерной. Получить девушке высшее образование в начале XX века в США было, ох, как не просто, а чернокожей девушке — сложнее вдвойне! Отец Уильям, сожалея об этой несправедливости, создал на базе университетской больницы бесплатные женские курсы лабораторных техников. Примечательным было то, что окончившие курс женщины, хоть и получали соответствующий сертификат об освоении профессии лаборанта, однако, согласно американскому законодательству, не имели права работать по специальности. Курсы были своего рода «факультативом для скучающих дам», но Уильям Хинтон и его дочь Джейн верили, что однажды ситуация изменится.
В 1939 году Уильям Хинтон познакомился в Гарварде с руководителем университетской микробиологической лаборатории Джоном Мюллером, который показался ему очень умным и порядочным человеком широких взглядов, и попросил его устроить на неофициальную стажировку свою 20-летнюю дочь. Мюллер действительно был чужд каких-либо расовых предрассудков и ценил в людях только их ум, поэтому проведя небольшое собеседование с Джейн, он с удовольствием согласился.
Из-за дискриминационной жилищной политики в Бостоне Джейн Хинтон с семьей вынуждена была жить в негритянском квартале, и поэтому просыпалась ни свет, ни заря, чтобы успеть доехать на велосипеде до Гарварда к началу рабочего дня. Затем она пересекала территорию университетского кампуса, продираясь сквозь сотни ненавидящих взглядов и ехидных усмешек. Ну, а добравшись до лаборатории, могла «спокойно» поработать в атмосфере неприятного перешёптывания коллег-лаборантов. Здесь стоит напомнить, что описываемые события происходили в эпоху расцвета расовой сегрегации в США, когда под лозунгом «Separate but equal» (англ. «Разделённые, но равные») негры должны были жить в отдельных районах (по сути гетто), ездить на отдельном транспорте, сидеть в кинотеатре на отдельных местах и пользоваться отдельной уборной «для цветных». Вот как рассуждал, например, в то время один из видных членов попечительского совета Гарварда — профессор истории Альберт Бушнелл Харт: «Чернокожая раса является низшей, и вся её прошлая история в Африке и Америке приводит меня к убеждению, что она всегда будет оставаться низшей в плане выносливости и возможных достижений». До начала движения Мартина Лютера Кинга за гражданские права чернокожих оставалось ещё долгих 15 лет...
Джейн Хинтон родилась сильной духом, поэтому стоически выносила все трудности, тем более что с начальником у неё было абсолютное взаимоуважение и понимание. Джон Мюллер предложил своей молодой ассистентке перспективное направление исследований, а именно создание прозрачной агаровой среды для культивирования гонококка и менингококка. Мюллер был старым воякой и знал, что вновь разгоревшийся пожар в Евразии рано или поздно перекинется и на их дом, и что бравым американским морпехам снова придётся выдвигаться к далёким чужим берегам. Также не понаслышке он знал и о том, что одной из главных проблем, с которой столкнётся армия, помимо вражеских пуль и снарядов, станут венерические заболевания (80% из которых приходились в то время на гонорею). Лечение инфекции правильными препаратами требовало, сперва, правильной диагностики, поэтому исследование Мюллера и Хинтон было крайне актуальным. До этого гонококки культивировались на различных средах, каждая из которых имела свои недостатки. Например, шоколадный агар Difco был тёмным, что затрудняло измерение размера и количества бактериальных колоний на нём, а среды, содержащие сыворотку, нельзя было нагревать под давлением. Мюллер предложил начать исследования с хорошо изученного им 20 лет назад агара для менингококков, который содержал триптический мясной перевар и экстракт гороховой муки. С помощью простейшего фракционирования микробиологи разделили гороховый экстракт на составляющие и протестировали каждый из них по отдельности: к их глубокому удивлению выяснилось, что росту бактерий способствовал крахмал, а не белок. Они предположили, что крахмал действовал как губка, впитывая химические вещества, которые могли быть токсичными для бактерий (впоследствии это блестящее предположение подтвердилось). Затем Мюллер дал задание Хинтон поэкспериментировать с мясным переваром и заменить его на более быстрый в приготовлении мясной настой с гидролизатом казеина. Полученный таким образом агар прекрасно подходил для выращивания гонококков и менингококков и превосходил все альтернативные среды.
В 1941 году в журнале Experimental Biology and Medicine были опубликованы результаты работы американских микробиологов: Джон Мюллер был достаточно бескорыстным и честным человеком, поэтому не побоялся указать в авторах статьи свою чернокожую коллегу, не имевшую на тот момент даже высшего образования. История науки знает много примеров, когда те или иные заболевания, изобретения и пр. получали название по имени учёного, стоящего первым в списке авторов прославившей их статьи, но, к счастью, это был не тот случай. Эпоним «агар Мюллера-Хинтон» прочно вошёл в лексикон микробиологов по всему миру. Это произошло не только потому, что их среда отлично послужила по своему прямому назначению, став прочным фундаментом для дальнейших прорывных исследований нейссерий, но ещё и потому, что спустя 25 лет американцы Кирби и Бауэр утвердили стандарт проведения оценки антибиотикочувствительности на агаре Мюллера-Хинтон с помощью диско-диффузионного метода. По их мнению среда идеально подходила для этого, т.к. позволяла расти широкому спектру организмов, не разлагала антибиотики благодаря своей нейтральности и обеспечивала лёгкое проникновение (диффузию) антибиотика, помещённого на её поверхность.
Большие людские потери во Второй мировой войне заставили правительство США пересмотреть свою гендерную и расовую политику: из-за нехватки рабочих рук и квалифицированных кадров женщин и «цветных» стали активно принимать на работу и в ВУЗы. С началом войны Джейн Хинтон перешла в лабораторию в Аризоне, где помогала в борьбе с тропическими заболеваниями. После войны она поступила в Университет Пенсильвании на ветеринарный факультет. В 1949 году Джейн Хинтон стала первой чернокожей женщиной в США, защитившей степень доктора ветеринарных наук. Несколько лет она проработала простым ветеринарным врачом, пока в 1955-ом не перешла в федеральную службу по ветеринарному надзору штата Массачусетс, где помогала исследовать и лечить болезни домашнего скота вплоть до самой пенсии.
Что касается Джона Говарда Мюллера, то в 1940 году он возглавил кафедру бактериологии в Гарварде, однако, несмотря на административные обязанности, продолжал работать «своими руками» в лаборатории, перейдя после дифтерии к изучению возбудителя столбняка. Он всегда учил студентов, что исследования должны быть ориентированы на клиническую практику и помимо фундаментального научного значения иметь конечную пользу для медицины.
«Мюллер был человеком большой щедрости, обладавший безупречной репутацией — особенно в отношении научной точности — и необычайной способностью отмахиваться от всего не относящегося к делу, что помогало ему всегда добраться до сути. Ему было не до притворства, полуправды или претенциозности. На тех, кто хорошо его знал, всегда производила впечатление его скромность.»
Источники и дополнительные материалы:
- Pappenheimer Jr., A. M. (1987). "John Howard Mueller". Biographical Memoirs of the National Academy of Sciences. Washington, DC: National Academy Press. 57: 307–321.
https://clck.ru/342zXf - Gye, W. E.; Mueller, J. Howard (1929). "An Experimental Study of the Etiology of Chicken Sarcoma I (Rous)". The Journal of Experimental Medicine. 49 (2): 195–213.
doi:10.1084/jem.49.2.195 - Mueller JH; Assistance of Mary G. Mueller, Alberta Marx, Ashton Graybiel, and D. W. Sherwood. AN EXPERIMENTAL STUDY OF GYE'S CANCER THEORY. J Exp Med. 1927 Jan 31;45(2):243-62.
doi: 10.1084/jem.45.2.243 - Mueller, J. H., & Hinton, J. (1941). A Protein-Free Medium for Primary Isolation of the Gonococcus and Meningococcus. Experimental Biology and Medicine, 48(1), 330–333.
doi: 10.3181/00379727-48-13311 - "Hinton, William Augustus 1883–1959 ." Contemporary Black Biography. Encyclopedia.com
https://clck.ru/344mgg - Erica Mitchell, «Dr. Jane Hinton: Co-Developer of Mueller-Hinton Agar», HEALTH. CARE. | AN EDUCATIONAL BLOG
https://blog.eoscu.com/blog/jane-hinton - D. Calidas, «How Jane Hinton cultivated gonorrhea and saved us from antibiotic resistant bugs»
https://clck.ru/344kVp - Long Legacies of Slavery: Segregation, Marginalization, and Resistance at Harvard
https://clck.ru/344YrV